　　利什曼原蟲試劑盒應(yīng)用雙抗原夾心法測定標(biāo)本中人利什曼原蟲抗體水平。用純化的人利什曼原蟲抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中依次加入利什曼原蟲抗體，再與HRP標(biāo)記的利什曼原蟲抗原結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色。

　　1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

　　2．根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。

　　3．加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時(shí)。

　　4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

　　5．每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

　　6．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

　　7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。

　　8．取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。

　　9．在450nm波長處測定各孔的OD值。

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